顺铂通过诱导膀胱癌细胞自噬促进细胞凋亡

？目的：研究自噬在顺铂引起膀胱癌细胞凋亡中的作用。方法：以膀胱癌细胞t24为细胞模型，利用透射电镜观察自噬泡形成，荧光显微镜观察转染绿色荧光蛋白和微管相关蛋白1轻链3融合蛋白（greenfluorescentproteinandmicrotubuleassociatedprotein1lightchain3fusionprotein，gfp-lc3）的质粒的荧光聚集情况。应用蛋白质免疫印迹检测lc3-ⅱ的积累，检测顺铂能否诱导膀胱癌t24细胞发生自噬。此外，蛋白质免疫印迹还被用来检测自噬相关信号通路哺乳动物雷帕霉素受体（mammaltargetofrapamycin,mtor）及其下游相对分子质量70000的核糖体蛋白质s6激酶（70000ribosomalproteins6kinase，p70s6k）的变化，以及凋亡标志蛋白聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(polyadp-ribosepolymerase，parp)的切割，之后利用3-(4,5-二甲基)-5-(3-羧甲基苯环)-2-(4-硫基苯)-2h-四唑盐复合物检测法［3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2h-tetrazolium,innersalt，mts］观察在自噬促进剂雷帕霉素（rapamycin）存在与否的情况下顺铂引起的膀胱癌细胞活力变化。本实验还使用了rna干扰技术敲降lc3表达。结果：电子显微镜显示相比对照组，顺铂可以引起膀胱癌细胞出现大量自噬泡。荧光显微镜观察gfp-lc3聚集程度，顺铂组也明显高于对照组。蛋白质免疫印迹检测lc3的结果发现顺铂组的lc3-ⅱ含量随时间延长和顺铂浓度增加而明显增加，尤其是在48h时，50与100μmol/l顺铂处理下lc3-ⅱ/actin（%）的灰度值分别升高了30和44，而mtor/p70s6k的磷酸化也受到顺铂处理的抑制，在48h，100μmol/l顺铂处理下其磷酸化条带几乎完全被抑制。mts结果发现顺铂可导致细胞活力的丢失，在50和100μmol/l顺铂处理24h时分别下降了12%和35%，而且用自噬促进剂雷帕霉素和顺铂联合处理组的细胞活力丢失大于单用顺铂处理的对照组（f=74.890，p<0.01）。rna干扰实验显示，敲降自噬相关基因lc3，可减少顺铂引起的parp剪切，细胞凋亡减少。结论：发现顺铂可以引起膀胱癌细胞t24发生自噬，并发现该自噬的作用能促进顺铂诱导的细胞凋亡。