西罗莫司对肌成纤维细胞表达ⅰ型胶原和纤维连接蛋白的抑制作用

？目的:在细胞水平探讨西罗莫司[sirolimus,又名雷帕霉素(rapamycin)]的抗肾纤维化作用.方法:采用原代培养的大鼠肾皮质肌成纤维细胞(myofibmblast,myof).实验各时间点分别设对照组和用西罗莫司40mg/l处理组.将细胞培养12h,24h,48h后分别收集细胞和细胞培养上清液,用westernblot方法检测细胞内α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-sma)、纤维连接蛋白(fibronectin,fn)、ⅰ型胶原(typeⅰcollagen,col-ⅰ)和上清液中fn,col-ⅰ蛋白水平的表达;用实时荧光定量pcr(real-timequantitativepcr)法检测细胞培养1h,2h,4h,6h各时间点前胶原ⅰ(procollagen-ⅰ)mrna表达的变化;用明胶酶谱法检测细胞培养上清液中基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase-2,mmp-2)和基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9,mmp-9)的活性.实验结果分别以各时间点对照组作为基线1,计算与对照组的比值.结果:(1)西罗莫司于各个时间点对细胞内α-sma的表达均无影响.(2)用西罗莫司处理后,于24h对细胞内col-ⅰ蛋白表达量明显少于对照组,并持续至48h,分别为各时间点对照组的(0.58±0.05)倍和(0.63±0.18)倍,差异有统计学意义(p<0.05).(3)与各时间点对照组相比,细胞内procollagen-ⅰmrna在1h,2h时表达均减少,分别为(0.38±0.05)倍和(0.55±0.16)倍,差异有统计学意义(p<0.05),于4h恢复到基础水平.(4)培养细胞上清液中12h即有col-ⅰ基础表达,经西罗莫司处理24h其表达量较对照组明显减少,为对照组的(0.59±0.25)倍,差异有统计学意义(p<0.05),持续至48h仍呈减少趋势.为对照组的(0.52±0.21)倍,p<0.05.(5)细胞内fn蛋白表达趋势与上清液中一致,24h其表达量较对照组明显减少,分别为对照组的(0.44±0.09)倍和(0.40±0.15)倍,差异均具有统计学意义(p<0.05),48h西罗莫司对fn的抑制作用消失.(6)经西罗莫司处理12h,24h和48h,上清液中mmp-2和mmp-9的活性均无明显变化.结论:西罗莫司可以通过抑制myof的col-ⅰ和或fn的表达而发挥其抗肾纤维化的作用.