ctbp1基因shrna真核表达载体的构建及其干扰效果的初步鉴定

？目的：构建c-末端结合蛋白-1(ctbp1)基因rna干扰(rnai)的真核表达载体，转染人子宫内膜癌耐药细胞株b-md-c1(adr＋/＋)，初步鉴定其干扰效果。方法：以人ctbp1基因为靶基因，以pgenesil-1质粒为载体，根据genbank数据库提供的ctbp1基因核苷酸序列，选择设计两条sirna干扰序列，将带9个碱基茎环结构的干扰序列插入带有绿色荧光蛋白(egfp)基因、卡那霉素(kanr)抗性基因及u6启动子的真核表达载体pgenesil-1中，构建针对ctbp1基因的shrna真核表达载体，转化大肠杆菌dh5α菌株，提取质粒，进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。确认载体构建成功后，用脂质体lipofectaminetm2000将重组质粒瞬时转染人子宫内膜癌耐药细胞株b-md-c1(adr＋/＋)，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达，计数转染细胞数，计算转染效率，rt-pcr法检测载体对ctbp1基因的表达抑制效果。结果：构建针对ctbp1基因的pgenesil-1-ctbp1小发夹rna(pgenesil-1-ctbp1-shrna)，经限制性内切酶酶切、pcr和dna测序证实与设计完全一致；在荧光显微镜下观察到b-md-c1(adr＋/＋)细胞表达绿色荧光蛋白(egfp)，证实重组质粒己转染入细胞，转染效率达到60％～70％；rt-pcr结果显示b-md-c1(adr＋/＋)细胞中ctbp1基因被特异抑制，基因表达抑制率达40％以上，与转染试剂对照组、空白对照组和阴性序列对照组间的差异均具有统计学意义(p均<0.05)。结论：成功构建ctbp1基因的shrna表达载体，可以有效抑制b-md-c1(adr＋/＋)细胞上ctbp1基因表达。为进一步研究ctbp1基因功能进而逆转肿瘤的多药耐药奠定基础。