负链rna病毒反向遗传通用载体的构建与鉴定

？目的：用于负链rna病毒的重组技术称为反向遗传技术，其核心需要构建一个具有双向启动子的反向遗传通用载体，可以分别正向转录翻译病毒复制所需酶系和负向转录病毒负链rna。为此，构建负链rna病毒反向遗传通用的载体。方法：为提高转染和表达效率，首先改造pcdna3载体，通过酶切删除pcdna3载体中非必需序列，在保留amp抗性的前提下，通过酶切去除pcdna3载体中非必需的kan抗性表达盒与cmv启动子前区。利用长引物合成含有反向poli启动子与多克隆位点的基因片段。将合成后的片段酶切、补平粘端、连接，反向插入至经改造后的pcdna3载体中，构建反向遗传通用表达载体。采用pcr检测、酶切鉴定以及dna测序进行验证。结果：pcr检测、酶切鉴定以及dna测序结果表明，载体构建正确，合成及插入序列与预期设计完全一致。结论：成功构建具有cmv与poli双向启动子的反向遗传通用载体，为建立负链rna病毒反向遗传平台提供了研究基础。