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癌变·畸变·突变 1999
croc-1基因与细胞增殖控制Abstract: ?目的:croc-1是人体细胞内新近发现的一个编码泛素缀合酶样蛋白(ubiquitin2conjugatingenzymelikeprotein,ubc2likeprotein)基因。已知croc-1基因的酵母同源基因mms2参与酵母细胞内rad6途径中的无误性复制后修复通路。酵母mms2无功效突变株表现出rev3依赖性增变表型(mutatorphenotype)。人croc-1基因是否与酵母mms2基因一样,参与人体细胞内的无误性复制后修复、维持基因组的稳定性,至今未见有文献报道。为此,我们运用反义技术建立croc-1基因表达被阻断的fl-croc-1-细胞系,通过研究该细胞系的一系列生物学特性来分析croc-1基因与dna修复、基因组稳定性维持、致癌物诱发的遗传不稳定性及肿瘤发生之间的关系。方法:11croc-1反义rna表达质粒的构建:用accⅰ酶从pbluescript2croc21b上切出840bp长包含croc-1b蛋白整个开放阅读框的cdna片断,用klenow片断将其两端填平,再用t4dnaligase在目的片断的两端连上salⅰlinker,而后经salⅰ酶切使其两端皆为salⅰ粘性末端,再将目的片断用t4dnaligase连到本室改建的真核细胞表达载体pmamneo2amp2的多克隆位点的salⅰ切点(经过cip处理脱去磷酸基团)上,最后用nheⅰ酶切(在插入片断上的上游载体的多克隆位点上及插入片断的内部第622位碱基处分别有一nheⅰ切点)并分析酶切图谱,从而筛选出反向插入的表达croc-1反义rna重组子;21细胞转染及筛选:用改良的磷酸钙法将构建的croc-1反义rna表达重组质粒pmamneo2anticroc2120230μg转染培养的人羊膜fl细胞,经g418筛选培养(400μg/ml),3周后可见细胞克隆,然后换成含g418的维持培养基(200μg/ml)继续扩大培养成fl-croc-1-细胞系,同时转染空载体pmamneo2amp2建立fl-mamneo细胞系作为载体对照;31细胞生长曲线测定:将fl、fl-mamneo及fl-croc-1-细胞分别以3(104cells/ml)种于24孔培养板,每种细胞6组,每组4个复孔,经地塞米松(工作浓度为10-5mol,用于诱导重组质粒pmamneo-anticroc-1表达croc-1反义rna)诱导于37℃、5%co2下培养24小时,第二天开始每天计数,计6天。结果:构建好的重组质粒经nheⅰ酶切,酶切产物琼脂糖电泳后其一个重组质粒出现228bp及9kb二条带,说明该重组质粒是反向插入的表达croc-1反义rna的重组质粒pmamneo2anticroc-1;pmamneo2anticroc-1、pmamneo2amp2分别转染fl细胞,经筛选培养,3周后分别得到10多个细胞克隆,换以维持培养基扩大培养成fl2croc21、flmamneo细胞系并冻存备用;细胞计数发现,头3天内fl2croc212细胞的生长速度与对照fl及fl2mamneo细胞的生长速度无明显差异,从第4天开始,fl2croc212细胞的生长速度较对照fl及fl2mamneo细胞的明显要慢,统计分析结果差异明显(p<0.05)。结论:11本研究成功地建立了croc-1基因表达被阻断的fl-croc-1细胞系;21本研究结果说明croc-1基因编码的泛素缀合酶样蛋白在细胞的生长过程中起正调控作用。
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