hmms2基因表达反义阻断后抑制细胞的生长

？目的:hmms2是人体细胞内新近发现的一个编码泛素缀合酶样蛋白(ubiquitin2conjugatingemzymelikeprotein,ubc2likeprotein)基因。已知hmms2基因的酵母同源基因mms2参与酵母细胞内rad6途径中的无误性复制后修复通路。酵母mms2无功效突变株表现出rev3依赖性增变表型(mutatorphenotype)。人hmms2基因是否与酵母mms2基因一样,参与人体细胞内的无误性复制后修复、维持基因组的稳定性,至今未见有文献报道。为此,我们运用反义技术建立hmms2基因表达被阻断的fl-hmms2-细胞系,通过研究该细胞系的一系列生物学特性来分析hmms2与dna修复、基因组稳定性维持、致癌物诱发的遗传不稳定性及肿瘤发生之间的关系。方法:11hmms2反义rna表达质粒的构建:用pstⅰ酶从pblue2script2hmms2上切出837bp长包含hmms2整个开放阅读框的cdna片断,用t4dna聚合酶将其两端切平,再用t4dna连接酶在已切平的目的片断两端连上salⅰ连接子,而后经salⅰ酶切使其两端皆为salⅰ粘性末端,再将目的片断两端用t4dna连接酶连到本室改建的真核细胞表达载体pmamneo2amp2多克隆位点的salⅰ切点(经过cip处理脱去磷酸基团)上,最后用nheⅰ、bstxⅰ双酶切(在插入片断的上游载体的多克隆位点有一nheⅰ切点,而插入片断的内部第296位碱基处有一bstxⅰ切点)并分析酶切图谱,从而筛选出反向插入的表达hmms2反义rna的重组子;21细胞转染及筛选:用改良的磷酸钙法将构建的hmms2反义rna表达重组质粒20-30μg转染培养的人羊膜fl细胞,在37℃5%co2条件下用含g418(400μg/ml)的mem全培养液进行筛选培养,每隔2-3天换一次液,同时用空载体pmamneo2amp2转染fl细胞,以建立fl-mamneo细胞系作为载体对照;31细胞生长曲线测定:将fl、fl-mamneo及fl-hmms2-细胞分别以3×104cells/ml种于24孔培养板,每种细胞36组,每组4个复孔,经地塞米松(工作浓度为10-5mol,用于诱导转染的重组质粒表达hmms2反义rna)诱导于37℃5%co2条件下培养24小时,从第2天开始每天计数,共计6天。结果:构建好的重组质粒经nheⅰ、bstⅰ双酶切,酶切产物琼脂糖胶电泳后其中一个重组质粒出现553bp及8.7kb二条带,说明该重组质粒就是反向插入的表达hmms2反义rna的重组质粒pmamneo2antihmms2。pmam2antihmms2、pmamneo2amp2分别转染的fl细胞,经g418筛选培养,3周后各得到10多个细胞克隆,而后换以维持性培养液(g418200μg/ml)继续培养并扩大成fl2hmms2、fl2mamneo细胞系并冻存备用。细包计数结果发现,头3天内fl2hmms22细胞尚能缓慢生长,但从第4天开始fl2hmms22细胞其生长基本处于抑制状态,比较对照fl及fl2mamneo细胞的生长速度发现,fl2hmms22细胞系的生长速度明显要慢,统计分析结果差异显著(p<0.05)。结论:11本研究成功地建立了hmms2基因表达被阻断的fl-hmms2-细胞系;21本研究说明hmms2基因是细胞生长所必需的基因。