trka特异小干扰rna表达载体构建及对乳腺癌细胞增殖的影响

？背景与目的：构建trka特异小干扰rna(sirna)表达载体，并观察其对神经生长因子(ngf)促细胞增殖作用和对细胞周期的影响。材料与方法：通过genbank提供的trka基因mrna全序列,应用设计软件选择设计能转录短发夹状rna(shorthairpinrnas,shrna)的dna序列，并与psilencertm4.1-cmvneo质粒载体连接，经dna测序鉴定重组体dna序列正确后转染乳腺癌mcf-7细胞。利用g418筛选稳定表达trka-sirna的mcf-7细胞株，通过real-timepcr、westernblot和免疫组化在mrna和蛋白水平检测trka的表达水平。mtt法检测trka干扰后ngf对细胞增殖作用的影响。流式细胞术观察细胞周期的变化。结果：序列测定表明成功构建trka-sirna表达载体，real-timepcr显示trkamrna下调74.7％(p<0.05)，westernblot显示蛋白表达下降80.5％，免疫组化结果也显示trka蛋白表达下降。试剂盒提供阳性对照gapdh基因其表达水平下降85.0％(p<0.05)。mtt检测显示，ngf组细胞增殖反应均较ngf＋sirna组、sirna组和对照组明显升高(p<0.05)，ngf＋sirna组的细胞增殖反应较其余各组下降(p<0.05)，表明trka干扰能有效抑制ngf诱导的乳腺癌细胞mcf-7的增殖。流式细胞术检测细胞周期结果显示：与对照组相比，ngf＋sirna组和sirna组细胞g0/g1期增加，s期减少(p<0.05)，细胞周期阻滞于g0/g1期。结论：trka特异sirna表达载体有效下调trka基因的表达，并抑制ngf引起的细胞增殖效应。