中药青蒿鲨烯合酶的大肠杆菌表达、纯化与功能鉴定

摘要利用pcr方法，将经race方法克隆到的中药青蒿鲨烯合酶cdna(af302464)开放阅读框的3′末端截短99bp，插入到原核表达载体pet30a(+)的ncoⅰ和bamhⅰ酶切位点之间，构建n端和c端均携带有his6表达标签的鲨烯合酶重组表达载体petssa.将petssa转入大肠杆菌bl21(de3)，0.5mmol/liptg(isopropyl？beta？d？thiogalactoside)28℃诱导重组鲨烯合酶的表达.表达产物经镍琼脂糖柱纯化.纯化蛋白加入酶促反应体系(含fpp和nadph)，gc-ms分析酶促反应体系的正己烷萃取物，结果显示重组鲨烯合酶可以催化fpp向鲨烯的转化.青蒿鲨烯合酶的功能鉴定为进一步利用反义或rnai技术限制甾类生物合成，从而提高青蒿中的青蒿素含量提供了基础.图5参15