l-山梨糖还原酶基因在大肠杆菌中的表达及融合蛋白的酶学特性

摘要为获得l-山梨糖还原酶（sr）整个操纵子序列，以pgem？3zf(+)作为载体构建了gluconobactersp.s6基因文库.结合转化子在以l-山梨糖为唯一碳源培养基上的生长情况，利用pcr技术筛选到一个含l-山梨糖还原酶基因的阳性克隆pgem？3zf(+)？sr3/e.coli，酶切鉴定插入片断长度约5.0kb左右.以pgem？3zf(+)？sr3/e.coli质粒dna为模板，扩增sr结构基因.pcr产物经测序验证为sr基因序列后，与表达载体pet32a(+)相连，转化宿主大肠杆菌ad494(de3)对sr基因进行表达，并利用重金属离子亲和层析技术对sr融合蛋白进行了纯化，对其酶学特性进行了研究.结果表明：还原型辅酶ii（nadph）是sr酶蛋白的最适电子供体；sr酶蛋白的最适反应ph为7.0，ph为6.5时保持稳定，酶活力较高；最适反应温度是50℃，30℃时热稳定性较好.sds？page电泳分析，sr融合蛋白的mr在65×103左右，由此推测出天然sr的mr在53×103左右，与sr基因序列推测出的分子量大小一致.图13表2参6