乳酸杆菌食品级表达系统的构建与鉴定

以lacf为选择标记，构建了乳杆菌食品级表达系统.首先克隆了latobacilluscaseiatcc393乳糖操作子lacf和lacg基因片段，将lacf克隆至载体prv300上后，利用t4dna聚合酶消除了lacf片段的sphⅰ位点，构建了lacf基因编码区移码突变的质粒prv△lacf，随后将lacg片段与质粒prv△lacf连接后获得了质粒prvg△lacf.同时将没有移码突变的lacf和lacg基因片段克隆至载体prv300上，构建了整合型载体prvgf.将质粒prvg△lacf电导入l.caseiatcc393中，筛选到不能在乳糖平板上生长的突变菌株.经pcr分析表明，该菌株的lacf基因被移码突变基因lac△f所取代，命名为l.caseimbl25(lacf-).为了鉴定此系统的可行性，将豆豉溶栓酶基因成熟肽编码片段插入到整合型载体prvgf中，成功构建了质粒prvgf-badfe，将其导入l.caseimbl25(lacf-)后，筛选lacf+菌株.pcr分析结果显示，豆豉溶栓酶基因已经整合到l.casei染色体中并且表型已经得到恢复.表明mbl25(lacf-)中lacf基因的功能能被prvgf-badfe上的lacf基因互补.经0.5%乳糖过夜诱导后，sds-page电泳显示成功表达了相对分子质量(mr)28×103大小的特异蛋白.图3参22