真核表达人wnt7b基因建立软骨细胞退变模型

目的在真核细胞中表达人wnt7b基因并且观察对大鼠原代软骨细胞的退变作用。方法取出生24hsd大鼠关节处软骨，ⅱ型胶原酶多次消化后获得原代软骨细胞，取p1代细胞进行实验。扩增人wnt7b基因及克隆至pcdh-gfp上，转染pcdh-gfp和pcdh-wnt7b至293ft细胞中，48h后收集细胞上清及转染细胞，westernblot鉴定wnt7b在293ft细胞中的表达。收集的上清分别稀释10倍和50倍培养大鼠软骨细胞，24h后观察细胞形态并收集细胞蛋白和抽提rna，westernblot和定量pcr检测软骨退变指标mmp13、mmp3、ⅱ型胶原、a-can、adamts5、colⅹ和sox9的表达。结果成功克隆人wnt7b基因至pcdh-gfp载体上且在293ft细胞中得到有效表达。含wnt7b培养基干预软骨细胞24h后，软骨细胞形态由原来的多角形变成长梭形，wnt7b处理组软骨细胞mmp13和mmp3表达显著上调，ⅱ型胶原的表达下调。pcr结果表明a-can和sox9表达下降，colⅹ和adamts5表达增强。结论有效在真核细胞中表达wnt7b基因并且促进大鼠软骨细胞退变，建立软骨细胞退变的体外模型。