mir-144负性调节大鼠巨噬细胞toll样受体2的表达

目的明确toll样受体2（tlr2）与microrna144（mir-144）作用之间的关系。方法利用不同浓度的mir-144的模拟物（mimics）和抑制剂（inhibitor）瞬时转染大鼠巨噬细胞系nr8383细胞，rt-qpcr检测mir-144和tlr2及其下游分子tnf-α的表达。利用大鼠肝脏cdna为模板，pcr获取目的片段（即含mir-144野生及突变结合位点的tlr2mrna的3’utr区）；用sacⅰ、xbaⅰ双酶切pmirglo报告基因载体和含mir-144野生及突变结合位点的tlr2mrna的3’utr区，构建携带上述片段的双荧光素酶报告基因，并通过pcr、双酶切、dna测序鉴定构建的重组质粒，即pmir-tlr2-3’utr及pmir-mutant-tlr2-3’utr；并用mir-144的mimics与双荧光素酶报告基因共转染明确mir-144与tlr2mrna的3’utr区的靶向关系。结果瞬时转染100nmol/lmir-144mimics后，nr8383细胞中mir-144表达显著升高，而tlr2及其下游分子tnf-α表达显著下降；而100nmol/lmir-144inhibitor作用则相反。pcr和双酶切dna测序结果证实pmir-tlr2-3’utr及pmir-mutant-tlr2-3’utr重组载体构建成功；用100nmol/lmir-144mimics与空载体及上述两个构建体分别共转染hek293t细胞后，pmir-tlr2-3’utr转染组相对荧光素酶活性显著降低。结论mir-144通过靶向结合tlr2mrna的3’utr区负性调节tlr2及其下游促炎因子的表达。