hpv16e5蛋白原核表达、鉴定及真核表达稳定株的筛选

目的研究hpv16e5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对hpv16e5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的hpv16感染患者子宫颈细胞dna为模板,采用pcr方法扩增hpv16e5基因,经bamhⅰ和hindⅲ双酶切后插入相同酶切的pet32a(+)载体,转染jm109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经iptg对重组质粒进行蛋白诱导表达,sds-page和westemblotting检测目标蛋白表达情况。将bamhⅰ和xhoⅰ双酶切pet32(+)／e5质粒后取得的e5全基因片段转入pcdna3．1(+)空质粒,构建pcdna3．1(+)／e5真核表达质粒并对nih3t3细胞进行转染,最后用g418进行稳定表达株的筛选,并采用rt-pcr鉴定细胞内hpv16e5基因表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pet32／e5,在1mmol／liptg、28℃诱导条件下bl21(de3)菌体中hpv16e5-trx融合蛋白占菌体总蛋白的10％左右。真核表达质粒pcdna3．1(+)／e5在成功转染nih3t3细胞后于250μg/mlg418浓度时筛选21d得到了e5基因稳定表达株,rt-pcr产物测序得到了hpv16e5基因全序列。结论成功构建了pet32／e5原核和pcdna3．1(+)／e5真核表达质粒,hpv16e5蛋白在大肠杆菌和nih3t3细胞中的稳定表达,这些结果为进一步深入研究hpv16e5蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用奠定了坚实基础。