hiv-1b亚型包膜糖蛋白gp120基因真核表达载体的构建及其在hepg2细胞中的表达

目的克隆人类免疫缺陷病毒ⅰ型b亚型包膜糖蛋白gp120基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,进一步为制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的hiv核酸疫苗奠定基础。方法以克隆好的hiv-1b亚型u26942全基因质粒dna作为模板,根据genbank中gp120基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5’端分别引入bamhⅰ及xhoⅰ酶切位点,特异性地扩增gp120基因。ta克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gp120编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcdna3.1(+)/gp120。在脂质体介导下转染hepg2细胞,经g418压力筛选建立稳定转染gp120基因的细胞系,用rt-pcr及westernboltting检测其在hepg2细胞中的表达。结果重组质粒经bamhⅰ、xhoⅰ双酶切成5.4kb与1.44kb的片断,表明表达载体pcdna3.1(+)中插入了gp120基因片断,测序结果表明编码框正确。rt-pcr及westernblotting证实稳定转染gp120基因的hepg2细胞系中有该基因的表达。结论成功构建了hiv-1b亚型包膜糖蛋白gp120基因的真核表达载体pcdna3.1(+)/gp120,并在hepg2细胞中获得稳定表达。