细菌内毒素体外刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌一氧化氮实验模型的条件优化

目的优化细菌内毒素刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生no实验模型的条件。方法采用hank’s液灌洗小鼠腹腔，收集腹腔留居巨噬细胞，利用铜绿假单胞菌脂多糖（lps）作为内毒素刺激巨噬细胞产生no，以griess法检测培养上清液中no的浓度，考察细胞浓度、lps浓度、lps刺激时长、培养液体积等因素对巨噬细胞产生no的影响，优化实验条件，并用已知药物验证模型的可靠性。结果本实验条件下，细胞浓度对no的产生具有关键性影响，最适浓度为6×106个细胞/ml，96孔板中每孔100μl；lps浓度<1μg/ml时，no的产生随lps浓度的增加而增加（p<0.001），lps浓度>1μg/ml时，no的增加的幅度明显下降，当lps浓度为10μg/ml时，no产生达到峰值；no的产生随lps刺激时间的延长，其含量相应增加，24与48h之间的增加幅度大于48h与72h之间的增加幅度（p<0.05）；培养上清中no的含量与培养液的体积有一定关系，100μl时的no含量最高。阿司匹林(1mmol/l)、地塞米松(10μmol/l)、环孢霉素a(10μmol/l)均能明显抑制lps刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生no（p<0.001）。结论巨噬细胞浓度、lps浓度、lps刺激时长是建立内毒素刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌一氧化氮实验模型的主要影响因素。推荐方案为：巨噬细胞浓度5×106个细胞/ml，100μl/孔；lps浓度10μg/ml；lps刺激时长24h或48h；培养液体积100~200μl。