用fret技术研究tlr4和md-2的相互作用

目的利用荧光共振能量转移(fret)技术在活体细胞研究人toll样受体(tlr)4与髓样细胞分化蛋白2(md-2)的相互作用。方法用pcr方法扩增tlr4编码序列和md-2编码序列(不包括信号肽序列)并分别亚克隆入带tlr4信号肽的增强型青色荧光蛋白和增强型黄色荧光蛋白表达载体(pecfp-c1-sp,peyfp-c1-sp)中,重组质粒经酶切、序列鉴定分析后分别或共同转染hek293细胞,用荧光显微镜观察荧光蛋白表达和分布情况,并用常规的方法和受体光漂白的方法对共表达青色荧光蛋白(cfp)-tlr4和黄色荧光蛋白(yfp)-md-2的细胞进行fret分析。结果重组质粒在hek293细胞中得到表达,仅转染pecfp/tlr4或peyfp/md-2的细胞可见青色或黄色荧光主要分布在胞质内,以核周较多;而共转染pecfp/tlr4和peyfp/md-2的细胞可同时检测到青色和黄色荧光,主要分布在细胞膜,同时胞质也有少量表达。无论是用常规的方法还是受体光漂白的方法,对共表达cfp-tlr4和yfp-md-2的细胞进行fret分析结果表明有fret现象的发生,提示tlr4和md-2有相互作用并形成复合物。结论本研究为tlr4和md-2在活体细胞中的相互作用提供了直接的证据。