notch1胞内结构域慢病毒表达载体及干扰载体的构建

目的构建高滴度大鼠n1icd慢病毒过表达载体（lv-n1icd）及n1icd慢病毒干扰载体（lv-n1icd-shrna）。方法以大鼠cdna文库为模板，pcr法扩增n1icd，通过定向克隆构建pgc-fu-n1icd-3flag穿梭质粒；设计4对n1icd-shrna寡核苷酸序列，以构建gvc112-n1icd-shrna干扰质粒，将pgc-fu-n1icd-3flag和gvc112-n1icd-shrna共转293t细胞，检测flag的表达，筛选理想的gvc112-n1icd-shrna干扰质粒。将pgc-fu-n1icd-3flag或gvc112-n1icd-shrna与phelper1.0、phelper2.0共转293t细胞，以包装lv-n1icd和lv-n1icd-shrna，分别利用real-timepcr、药物筛选法进行病毒滴度测定。lv-n1icd及lv-n1icd-shrna分别感染h9c2心肌细胞，利用cck-8检测细胞活力。结果pgc-fu-n1icd-3flag和gvc112-n1icd-shrna质粒经pcr、基因测序及western-blotting验证构建成功，与phelper1.0、phelper2.0共转293t细胞后，取上清浓缩，分别获得高滴度lv-n1icd和lv-n1icd-shrna。lv-n1icd可明显提高心肌细胞活力，lv-n1icd-shrna可降低心肌细胞活力。结论lv-n1icd和lv-n1icd-shrna包装成功，具有notch1信号通路生物学功能。