用于时间分辨荧光免疫分析的结核分枝杆菌培养滤液蛋白10参照品的制备

摘要：目的通过基因工程技术制备结核分枝杆菌培养滤液蛋白10（cfp10）、链亲和素（sa）/cfp10融合蛋白（包括sa-cfp10、cfp10-sa)，筛选灵敏度最高、稳定性最好者作为时间分辨荧光免疫分析法检测（trfia）的参考标准品。方法以结核分枝杆菌h37rv标准株基因组为模板，扩增cfp10基因，将其克隆到pet24b、pet24b-sa、pet21a-sa三种载体中，转化到大肠杆菌rosetta中进行表达，表达产物经镍离子亲和层析（ni-nta）柱纯化，透析法复性。三种重组蛋白用双抗体夹心法trfia从灵敏度、稳定性两方面进行评价。结果成功构建了pet24b-cfp10、pet24b-sa-cfp10和pet21a-cfp10-sa三种表达载体，重组蛋白cfp10主要为可溶形式表达，融合蛋白cfp10-sa、sa-cfp10均以包涵体形式存在，ni-nta柱纯化后透析复性，纯度均可达90%以上。三种重组蛋白经双抗体夹心trfia，cfp10-sa灵敏度最高（0.02μg/l），稳定性最好。结论得到了灵敏度高、稳定性好的trfia检测cfp10的参照品cfp10-sa融合蛋白，为研制该结核分支杆菌时间分辨荧光诊断试剂盒，并应用于临床打下了基础。