ap2α荧光素酶报告基因的构建及在bmps诱导成骨分化研究中的应用

目的构建一种携带转录蛋白ap2α效应元件的荧光素酶报告基因载体，并应用于筛选bmps对ap2α转录活性的影响。方法设计4个串联的ap2α效应元件(ap2α-re)，将其克隆至经bamhⅰ和mluⅰ双酶切的pbgluc荧光素酶报告基因质粒构建pbgluc-ap2α-re载体。重组腺病毒ad-ap2α及其两种显性负性突变体ad-dnap2α感染小鼠间充质干细胞c3h10，通过real-timepcr、westernblot检测ap2α的mrna和蛋白水平表达，emsa检测ap2α的dna结合能力。pbgluc-ap2α-re转染c3h10细胞，荧光素酶报告基因检测同上各组ap2α的转录活性。ad-bmps感染pbgluc-ap2α-re转染的c3h10细胞，荧光素酶报告基因筛选bmps对ap2α转录活性的影响。结果经pcr、酶切及测序鉴定，证实ap2α-re正确克隆至pbgluc-ap2α-re荧光素酶报告基因载体，ad-ap2α感染能显著提高ap2α的表达及结合dna的能力。显性负性突变体可以表达各自的突变体，emsa结果显示ad-dnap2α-△bhlh组能显著抑制ap2α结合dna的能力，而ad-dnap2α-△tad组结合的dna探针强于对照组。荧光素酶报告基因提示ap2α过表达组能促进ap2α转录活性，而两种显性负性突变体均能抑制ap2α转录活性。重组腺病毒bmps感染组的ap2α转录活性均有增高，其中bmp9最为显著。结论成功构建携带转录蛋白ap2α效应元件的荧光素酶报告基因载体用于检测ap2α的转录活性，并初步发现bmp9对ap2α的转录活性有明显的促进作用。