甲状旁腺素受体真核表达载体的构建及稳定转染hek293细胞系的建立

目的构建小鼠甲状旁腺素受体（pthr）及其突变受体（dsel）全长结构基因真核表达载体，建立稳定高表达pthr及dsel的hek293细胞系，以应用于甲状旁腺素（pth）模拟肽活性药物筛选及其信号通路的研究。方法通过双酶切、胶回收方法分别纯化目的片段(pthr、dsel基因)和质粒pcdna3.1（+），二者分别由dna限制性内切酶ecorⅰ与notⅰ双酶切，经t4dnaligase连接的方法将pthr、dsel基因克隆到质粒表达载体pcdna3.1（+）中，采用测序方法及dna限制性内切酶ecorⅰ与notⅰ双酶切方法鉴定重组质粒，脂质体转染法将重组体pcdna3.1（+）-pthr、pcdna3.1（+）-dsel及空质粒pcdna3.1（+）分别转染至hek293细胞，经g418筛选抗性细胞克隆，、rt-pcr及elisa检测转染细胞pthr、dsel的表达情况。结果重组质粒经基因测序及dna限制性内切酶ecorⅰ与notⅰ双酶切证实质粒表达载体pcdna3.1（+）-pthr、pcdna3.1（+）-dsel构建正确。重组体经脂质体法转染hek29348h后，经g418筛选3周得到细胞抗性克隆，elisa检测到pthr、dsel基因在重组质粒表达载体pcdna3.1（+）-pthr、pcdna3.1（+）-dsel转染的hek293中成功表达。rt-pcr方法检测到pthr、dsel基因在转录水平的表达。elisa方法检测到重组质粒转染的hek293中，加入甲状旁腺激素刺激后，plc、camp蛋白表达量远高于空质粒pcdna3.1（+）转染的hek293中plc、camp的表达。结论成功构建了稳定高表达pthr、dsel的hek293细胞，该稳定转染细胞系的建立为进一步研究甲状旁腺素受体下游信号通道的分子机制以及筛选其模拟肽作用的活性奠定了实验基础。