登革ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重复序列具有干扰病毒复制的作用

目的构建含有登革ⅱ型病毒（denv-2）前膜蛋白（prm）基因反向重复序列（irrna）的重组质粒，评价其抑制病毒复制的效果。方法denv-2接种乳鼠，提取总rna，在正义和反义引物两端分别加上xhoⅰ和ecorⅰ的识别位点，将经rt-pcr扩增的prm全长基因片段插入pcdna3.1(+)中，形成含有prm反向序列的重组质粒pcdna-asprm；于另一对正义和反义引物两端引入酶切位点nheⅰ和bglⅱ，经rt-pcr扩增prm全长基因片段插入pmd18-t-vector中，形成含有正向序列的重组质粒pmd18-t-prm。限制性内切酶nheⅰ和kpnⅰ分别酶切重组质粒pmd18-t-prm和重组质粒pcdna-asprm，得到片段prm和线性化载体pcdna-asprm，连接构建成含有prm反向重复序列的重组质粒pcdna-irrna。筛选的阳性重组质粒pcdna-irrna用脂质体法转染至bhk-21细胞中，半定量pcr和实时荧光定量pcr分析评估该质粒抑制登革病毒复制的效果。结果成功构建具有prm反向重复序列的重组质粒pcdna-irrna。经转染pcdna-irrna的实验组与未转染质粒阳性对照组相比，半定量pcr结果显示denv-2攻击96h后ns3的mrna表达水平下降28%；实时定量pcr分析显示，denv-2攻击72h后实验组病毒拷贝数比阳性对照组少1.44倍，攻击96h后实验组的ns1表达量明显低于阳性对照组（p<0.05）。结论denv-2prm反向重复序列具有干扰病毒复制的效果，为登革病毒基因疫苗的研究提供理论依据。