转基因番茄zenecab,da,f实时荧光定量pcr检测体系的建立

摘要：目的构建转基因番茄zenecab,da,f品系的质粒标准分子及其实时荧光定量pcr（qpcr）检测体系。方法基于反向遗传学原理构建分别含有番茄内标准基因apx检测序列（erg-apx），转基因番茄b,da,f品系pg基因的基因特异性序列（gs-pg）及其构建特异性序列（cs-16s、cs-16a）的番茄内参质粒标准分子peasy-t3-apx，转基因番茄b,da,f品系的构建特异性质粒标准分子peasy-t3-16a、peasy-t3-16s；以beacondesigner7.5设计用于定性pcr和qpcr检测的引物对和taqman探针；基于质粒标准分子建立了定性pcr和qpcr检测体系，对方法的特异性、敏感性、重复性、检测下限等指标进行评估；使用picogreen试剂盒对质粒标准分子进行定量，以质粒peasy-t3-apx为背景dna定量混有peasy-t3-16a或peasy-t3-16s制备成含量为1%和0.1%(w/w)的两组核酸标准物质，进行所构建qpcr检测体系的定量性能评价。结果锚定qpcr检测靶序列：erg-apx108bp,gs-pg108bp，cs-16s109bp、cs-16a102bp；酶切鉴定所构建的质粒标准分子均可得到预期大小的插入子片段；所建立的实时荧光定量pcr（qpcr）检测体系，重复性的相对标准差（rsd）0.2%~1.5%，检测下限25copies，标准曲线方程线性关系r2值在0.994~0.998，效率在93.3%~102.4%。经换算系数cf换算，对picogreen定量的样品进行验证，其实测值与真值的偏差是-9.7%~17.3%。结论成功构建了转基因番茄zenecab,da,f品系的质粒标准分子及其qpcr检测体系，为转基因番茄zenecab,da,f品系转基因成分的监测建立了可行的可供使用的定性与定量检测体系。