rnf31表达下调抑制tnf-α刺激的nf-κb通路的激活

目的利用慢病毒干涉下调内源性rnf31表达，研究nf-κb通路的活化及对细胞凋亡的影响。方法将人rnf31的shrna片段克隆到慢病毒表达载体pgreenpuro中，瞬时转染hek293t细胞，筛选出有效的干涉片段。将重组表达质粒与包装质粒pmd、spa共转染293t细胞，在24h、48h分2次收集慢病毒上清，用流式细胞术检测病毒滴度。将获得的病毒感染hek293细胞，提取细胞蛋白，real-timepcr以及westernblot检测rnf31干涉效果；报告基因实验检测敲低rnf31对nf-κb转录活性的影响；real-timepcr检测干涉rnf31对tnf-α诱导的nf-κb下游靶基因的影响；westernblot检测下调rnf31对iκbα活化的影响；hochest染色检测下调rnf31对细胞凋亡的影响。结果成功构建rnf31干涉慢病毒pgreenpuro-rnf31载体并获得慢病毒颗粒，病毒滴度可达3×107pfu/ml。在hek293细胞中下调rnf31，抑制tnf-α刺激的nf-κb的转录活性，并抑制nf-κb下游靶基因的表达；下调rnf31抑制tnf-α刺激的iκbα的活化；此外，在tnf-α刺激细胞24h时，rnf31表达下调使细胞凋亡增多。结论rnf31表达下调抑制tnf-α刺激的nf-κb通路的激活。