has-mir-335慢病毒表达载体的构建及其靶基因鉴定

接要：目的构建过表达mir-335的稳定细胞株sw620并筛选和初步鉴定mir-335的靶基因。方法扩增包含hsa-mir-335前体序列在内的基因片段，并将其亚克隆至plvthm慢病毒载体；扩增包含rasa13’utr种子区域的基因片段并将其亚克隆至psicheck-2载体，并对此重组载体进行定点突变构建psicheck-2-rasa1-mut；检测萤火虫荧光素值(f)和海肾荧光素值(r)，以r/f表示相对荧光素酶活性。流式细胞仪筛选建立稳定表达mir-335的细胞株，利用荧光定量pcr检测mir-335及其靶基因rasa1的表达，westernblot检测rasa1蛋白水平的表达。结果质粒双酶切以及测序鉴定plvthm-mir335、psicheck-2-rasa1、psicheck-2-rasa1-mut重组质粒构建成功。荧光定量pcr显示结直肠癌细胞中mir-335与rasa1表达趋势成负相关。双荧光素酶报告基因分析证实hsa-mir-335能够作用于rasa1的3’utr。稳定过表达mir-335的细胞中，mir-335的表达明显高于对照组和未处理组，蛋白质水平有所下降。结论成功构建了plvthm-mir-335慢病毒重组质粒，构建过表达mir-335的细胞株sw620，初步证实rasa1是mir-335的靶基因。