人微小抗肌萎缩蛋白基因转染大鼠骨髓间充质干细胞及其基因表达

目的构建人微小抗肌萎缩蛋白基因(microdystrophin)的真核表达载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞(rmsc),研究其体外表达情况。方法限制性酶切pbsk-micro质粒的微小抗肌萎缩蛋白基因片段,插入到真核表达质粒pcd-na3.1(+)的noti位点内,克隆出真核表达载体pcdna3.1(+)/microdystrophin。通过酶切和测序对质粒进行鉴定。用脂质体将重组质粒转染入rmscs中,经过g418筛选后,用rt-pcr及间接免疫荧光技术检测表达产物。结果pcdna3.1(+)/microdystrophin经过noti、hindiii酶切鉴定及测序证实插入片断正确。提取转染重组质粒rmscs的总rna,进行rt-pcr可见mrna的转录;对g418筛选后rmscs进行免疫荧光检测可见细胞内亮丽的红色荧光,说明转染后的rmscs有微小抗肌萎缩蛋白的表达。结论成功构建了人microdystrophin基因真核表达载体,将其转染入rmscs内有微小抗肌萎缩蛋白的表达,为进一步研究体外修饰自体干细胞移植治疗dmd奠定了基础。更多还原