应用nested和touchdownpcr技术分离牦牛capn1大亚基基因est

钙激活中性蛋白酶1(capn1)基因是影响肉嫩度的侯选基因。根据genebank中已公布的capn1基因cdna序列设计同源pcr引物，通过rt,nested和touch-downpcr技术从牦牛肌肉组织总rna中分离目的序列，与pgem-t-easy载体连接后转化dh5α感受态菌株，通过pcr扩增、限制性酶切和测序分析鉴定阳性克隆。分离到的基因片段为牦牛capn1大亚基的部分编码序列，在genebank中的注册号为ay197555,与奶牛、人、食蟹猴、小鼠、绵羊以及大鼠相应序列的同源性分别为98%，89%，89%，83%，96%和81%，在不同物种之间具有较强的保守性。capn1基因est的分离为进一步研究牦牛capn1基因奠定了基础。此研究表明，在总rna质量不理想的情况下，同时采用这2种技术可以较大限度地获取目的序列。