h5和h9亚型禽流感病毒反向斑点杂交同步检测法的建立

【目的】建立h5和h9亚型禽流感病毒的向斑点杂交鉴别诊断方法。【方法】在h5和h9亚型禽流感病毒血凝素基因的保守区段内，选择设计2对引物，rt-pcr扩增后将目的片段克隆到pgem-t载体中，得到重组质粒pgem-t-h5与pgem-t-h9。以重组质粒为模版，选择合成寡核苷酸探针与生物素标记引物。将探针通过紫外交联方法固定在带正电荷的尼龙膜上，用生物素标记引物扩增特异性片段，扩增产物经热变性后与探针进行杂交，杂交后显色，出现明显蓝紫色斑点的判定为阳性，无斑点判定为阴性。【结果】利用建立的反向斑点杂交方法检测，h5、h9亚型禽流感病毒的血凝效价分别可达到2-9.6和2-11.9，杂交特异性好，且2亚型间无交叉反应。【结论】建立了h5和h9亚型禽流感病毒的反向斑点杂交检测方法，该方法灵敏度高、特异性好，可以实现h5与h9亚型禽流感病毒的鉴别诊断。