切刻核酸内切酶pne45的原核表达与活性鉴定

【目的】对大肠杆菌噬菌体phiv10第45个基因编码蛋白pne45进行原核表达，并检测其酶活性。【方法】设计并合成10段密码子优化的寡核苷酸序列，采用重叠延伸pcr技术，将其拼接克隆，获得人工合成的pne45基因，然后将其整合入含有mbp纯化标签的pet21a原核表达载体中，构建重组载体pet21a-mbppne45，诱导表达后获得融合蛋白mbp-pne45。利用amylose亲和层析纯化融合蛋白mbp-pne45，以puc19为底物，分别在mg2+和mn2+参与下对mbp-pne45活性进行初步鉴定。【结果】融合蛋白mbp-pne45主要以可溶性形式表达，其表达量占细胞总蛋白的35%左右。pne45融合蛋白在mg2+缓冲液中具有dna随机切刻活性，在mn2+存在时还具有切刻位点对位切刻活性。【结论】首次成功表达并制备了pne45，并初步证明其是一种新的随机性切刻核酸酶。