西农萨能羊凝乳酶原基因的克隆与原核表达

【目的】克隆西农萨能羊凝乳酶原基因并进行原核表达，对表达产物凝乳酶原复性后进行活性检测，为西农萨能羊凝乳酶制剂的微生物发酵生产奠定基础。【方法】从西北农林科技大学西农萨能羊原种场新生公羔羊的皱胃组织中提取总rna，通过rt-pcr方法获得西农萨能羊凝乳酶原前体的编码序列,纯化后与pmd-18t载体连接，转化大肠杆菌jm109，通过双酶切和序列测定，获得了凝乳酶基因全长编码区序列。将该基因连接到原核表达载体pet-30a中，构建重组菌pet-30a/chymosin，经酶切、测序鉴定后进行凝乳酶的小量表达、大量表达、western杂交鉴定、纯化、复性和活性测定。【结果】通过rt-pcr方法获得了西农萨能羊凝乳酶原前体的编码序列，并构建了重组菌pet-30a/chymosin；通过体外原核表达获得了西农萨能羊凝乳酶原，将酶原进行复性后测得重组菌酶活力为93.2u/ml。【结论】利用西农萨能羊凝乳酶原基因，通过构建原核表达载体和体外表达可以得到凝乳酶原，通过蛋白纯化和复性可得到有活性的凝乳酶。