枯草芽孢杆菌高效表达系统的构建

【目的】优化枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)启动子和表达宿主，构建其高效的表达系统，为重组枯草芽孢杆菌的研究和应用奠定基础。【方法】以β-半乳糖苷酶编码基因为报告基因，以诱导型的枯草芽孢杆菌麦芽糖操纵元启动子为调控元件、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒为载体骨架，构建枯草芽孢杆菌高效表达载体pgj222，将其电转化到b.subtilis1a747菌株后进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。利用同源重组的方法，用枯草芽孢杆菌组成型启动子p43替换了b.subtilis野生型菌株1a747麦芽糖操纵元的上游调控序列，得到优化重组表达宿主菌b.subtilisbcyl，将pgj222转入b.subtilisbcyl后，对优化的表达系统进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。分别用pcr扩增大肠杆菌和枯草芽孢杆菌维生素b12合成前期途径的谷氨酰-trna合成酶编码基因hema，构建其表达载体，并将其转化b.subtilisbcyl中进行诱导表达检测。【结果】成功构建了枯草芽孢杆菌高效表达载体pgj222，并实现了β-半乳糖苷酶的高效表达，其表达量占总可溶性蛋白的18%；质量分数5%的麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到16u/ml。成功获得了优化重组表达宿主菌b.subtilisbcyl，其可使β-半乳糖苷酶活性有大幅度提高，在质量分数5%麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到21u/ml，葡萄糖的抑制作用明显减弱。【结论】通过对启动子和表达宿主的优化，获得了枯草芽孢杆菌高效表达系统，为枯草芽孢杆菌基因工程研究提供了有力工具。