人xiap基因多克隆抗体的快速制备方法研究

【目的】探索快速制备高品质x连锁凋亡抑制蛋白（xiap）多克隆抗体的方法，为研究xiap基因的功能及xiap蛋白在肿瘤组织中的表达量检测提供参考。【方法】通过rt-pcr方法获得人xiap基因的cds区序列，与pet151/d-topo载体连接，构建xiap基因的原核表达载体；考察细胞密度（od600）、iptg浓度、诱导温度和诱导时间对xiap重组蛋白表达量的影响，以确定xiap重组蛋白的最佳诱导条件，并用ni-nta亲和层析柱法纯化xiap重组蛋白；用纯化的xiap重组蛋白对2只成年新西兰白兔进行常规免疫后，再对其中1只进行耳静脉注射加强免疫，连续3d，每天免疫1次，用elisa检测抗体效价，westernblot检测抗体特异性。【结果】①通过rt-pcr方法获得人xiap基因的cds区序列，与pet151/d-topo载体连接，构建xiap基因的原核表达载体，测序后，与genbank中序列的的相似度为97%。②xiap重组蛋白的最佳诱导条件为：温度30℃，初始诱导细胞密度（od600）为0.6，iptg浓度0.5mmol/l，诱导时间4h。在此条件下，xiap重组蛋白多以包涵体的形式存在于细胞沉淀中。③利用ni-nta亲和层析柱法，在ph为5.9和4.5的洗脱液中均可获得质量浓度为600μg/ml的xiap重组蛋白。④耳静脉连续加强免疫是刺激动物机体快速产生抗体的有效方法（31d）。elisa和westernblot检测结果表明，耳静脉连续加强免疫产生的xiap抗体的效价和特异性均明显高于常规免疫所产生的抗体。【结论】耳静脉连续加强免疫能够显著提高xiap抗体的效价，且能有效缩短多克隆抗体的制备时间。