用反向遗传8质粒系统构建流感h1n1重组病毒

为了建立用于流感病毒拯救的反向遗传操作系统,用rt-pcr方法扩增得到a型流感病毒流行株a/shanghai/7/99的ha和na基因,将其克隆到pgem-t载体上并测序,挑选阳性克隆分别用bsmbⅰ、bsaⅰ酶切,连接到以bsmbⅰ酶切的双向转录/表达载体pad3000上,获得重组质粒pad-ha和pad-na,分别与含a/pr/8/34流感病毒7个基因的阳性质粒共转染cos-1细胞,拯救了重组病毒r-ha-pr8和r-na-pr8,说明构建的重组质粒pad-ha和pad-na是正确的,将pad-ha和pad-na与含a/pr/8/34流感病毒6个基因的阳性质粒共转染cos-1细胞,培养48h后吸取上清液及cos-1细胞,接种10日龄spf鸡胚,孵育96h后,收获鸡胚尿囊液进行血凝和血凝抑制试验。结果显示,鸡胚尿囊液中重组病毒h1n1的血凝效价和血凝抑制效价均为29,鸡胚半数感染剂量为10-8.5～10-9。病毒的成功拯救为进一步深入研究流感病毒的基因功能以及流感新型疫苗的研发奠定了基础。