应用半乳糖表型差异高效筛选α-1,3半乳糖苷转移酶基因缺失的猪成纤维细胞

【目的】筛选α-1,3半乳糖苷转移酶(α1,3galactosyltransferase，ggta1)基因缺失的猪成纤维细胞。【方法】用同源重组载体pbs-ggta1-sko和pbs-ggta1-dko电转染ggta1单等位基因敲除(ggta1＋/－)的五指山小型猪胎儿成纤维细胞，利用磁激活细胞分选(macs)、macs联合流式细胞术(facs)、tcda联合facs等3种方法进行细胞筛选；对macs筛选获得的单细胞克隆进行pcr和facs鉴定，对macs联合facs、tcda联合facs获得的细胞集落进行pcr鉴定。【结果】经macs筛选获得了11个细胞克隆，经鉴定2个是ggta1-/-细胞克隆，阳性率为18.2%；macs联合facs筛选获得了3个细胞克隆，经鉴定无ggta1-/-细胞克隆，阳性率为0；tcda联合facs筛选获得了3个细胞克隆，经鉴定均为ggta1-/-细胞克隆，阳性率为100%。【结论】macs法筛选和tcda联合facs法筛选这2种方法均可以高效筛选出ggta1双等位基因缺失的猪成纤维细胞，可用于进一步制备供异种器官移植的基因修饰小型猪。