重叠延伸pcr法构建小菜蛾化学感受蛋白1基因突变体研究

【目的】探索重叠延伸pcr法在昆虫化学感受蛋白基因点突变上的应用，研究半胱氨酸（cys32）对小菜蛾（plutellaxylostella）化学感受蛋白1（plxycsp1）结合特性的影响。【方法】用计算机软件模拟plxycsp1上cys32突变前后的蛋白三级结构以及与配体化合物的结合情况，确定点突变位点。根据扩增得到的plxycsp1序列设计并合成重叠引物，利用重叠延伸pcr法，将plxycsp1上的cys32突变成色氨酸（trp32），获得突变体plxycsp1-m。将突变后的基因与载体pet-32a(+)连接，转化大肠杆菌bl21(de3)。【结果】分子对接图显示，配体可以顺利进入plxycsp1的结合口袋，而无法进入plxycsp1-m的结合口袋。结合能预测显示，配体化合物与plxycsp1的结合能均为正值，与plxycsp1-m的结合能均为0。突变后的重组质粒测序结果表明，cys32（tgc）已突变为trp32（tgg），经iptg诱导，该菌表达了分子质量约为36ku的融合蛋白。【结论】cys32是影响plxycsp1结构和功能的重要氨基酸残基。cys32突变为trp32后，plxycsp1-m结合特性发生了变化，不能与配体化合物正常结合。