人抗凝血酶cys248位点突变体的构建与真核表达

【目的】建立一种对人抗凝血酶(at)cys248位点进行定点突变和真核表达的可靠方法，为突变体的结构和功能研究提供原始材料。【方法】以人atcdna序列为模板，设计1对反向扩增引物，进行反向pcr反应；pcr产物经连接、测序后，克隆至表达质粒pcdna3.1(+)-gfp上，构建重组真核表达载体pcdna3.1(+)-mat-gfp；用重组载体介导突变基因在山羊乳腺上皮(gme)细胞内表达，收集细胞培养上清液进行表达产物的定性、定量检测。【结果】突变基因经测序证实与预期结果一致，且在gme细胞内得到高效表达，细胞培养液上清中的突变体质量浓度为（526±17.3）mg/l。【结论】反向pcr法是对-at基因进行定点突变的可靠方法，at-突变基因在gme细胞内可高效表达。