耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

[目的]研究耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达,并检测其酶学性质.为耐热β-半乳糖苷酶的应用和工业化生产奠定基础.[方法]利用基因工程的原理和方法,将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热β-半乳糖苷酶基因(bgab)克隆到大肠杆菌pet表达系统(pet-28a(+)),并在大肠杆菌bl21(de3)中进行表达.将构建的重组菌(pet28a-bgab)在含硫酸卡那霉素的液体lb培养基中以iptg为诱导剂,对表达产物的最适反应温度、最适反应时间、iptg诱导浓度、热稳定性及酶促动力学进行检测.[结果]成功构建了表达载体pet28a-bgab,并测得耐热β-半乳糖苷酶的最适反应温度为65℃,最适反应时间为6h,iptg的最佳诱导浓度为1mmol/l,且具有良好的热稳定性;在诱导后6h,耐热β-半乳糖苷酶的表达量占菌体总可溶性蛋白的20%,表达效率较高;对透析蛋白进行蛋白质定量,蛋白质量浓度为0.75mg/ml,透析蛋白的耐热β-半乳糖苷酶活性为75u/ml,比活性为100u/mg;酶促动力学研究表明,耐热β-半乳糖苷酶的反应常数为0.398μmol/ml,最大反应速度为27.435μmol/(min·ml).[结论]耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中得到成功表达,并且在很大程度上提高了耐热β-半乳糖苷酶的活性.