萝卜ddrt-pcr技术体系的优化

[目的]探索快速高效的rna提取方法,建立高效率的mrna差异显示体系.[方法]以萝卜幼嫩薹叶及花蕾为材料,比较了酸性酚-异硫氰酸胍-氯仿提取法(异硫氰酸胍法)与biozol试剂法提取rna的效果,并对ddrt-pcr体系中taq酶、mg2+、dntps,引物及cdna用量进行了优化.[结果]biozol试剂提取的rna量大质好,经纯化后,其od260/od280值为1.8～2.1,表明杂质少,质量浓度大于1μg/μl,符合mrna差异显示的要求;确定的最佳ddrt-pcr反应体系(20μl)为:10×buffer2.5mmol/l,mg2+2.8mmol/l,dntps0.25mmol/l,taq酶1.5u,锚定引物2.5μmol/l,随机引物1.25μmol/l,cdna用量0.5μl。mrna差异显示结果表明,高分辨率的片断为100～1000bp.经验证,该体系也适用于大白菜和油菜mrna差异显示研究.[结论]通过两种rna提取方法比较和ddrt-pcr体系优化,获得了萝卜最佳rna提取方法及mrna差异显示反应体系.