人il-32-igg4（fc）融合蛋白在cho/dg44细胞中的表达

[目的]构建人白细胞介素32(il-32)和igg4fc段的融合基因真核表达载体il-32-igg4(fc)-poptivec,建立稳定转染的中华仓鼠卵巢细胞(cho/dg44)克隆,并检测其重组蛋白的表达.[方法]用pcr方法从脂多糖(lps)激活的人cd4+t细胞cdna中扩增出il-32蛋白基因,并克隆到igg4(fc)-poptivec载体上,构建重组质粒il-32-igg4(fc)-poptivec,并进行酶切和测序鉴定.采用脂质体法,将重组质粒线性化后转染cho/dg44细胞,进行rt-pcr检测,筛选阳性克隆,并对筛选的阳性克隆进行氨甲喋呤(mtx)加压筛选.利用proteing-agarose亲和层析纯化转染cho/dg44细胞培养上清液中的融合蛋白il-32-igg4(fc),通过sds-page、western-blot对融合蛋白il-32-igg4(fc)的表达和生物学活性进行检测.[结果]pcr扩增获得了长度为564bp的人il-32蛋白基因cdna,经测序与genbank报道的序列一致.真核表达载体il-32-igg4(fc)-poptivec经ecorⅰ和xhoⅰ双酶切,获得了il-32蛋白基因片段,其长度为564bp.筛选出了能稳定表达il-32-igg4(fc)融合蛋白的cho/dg44细胞克隆.亲和纯化后的il-32-igg4(fc)融合蛋白经sds-page和western-blot鉴定,其分子质量约为50.0ku,与预期结果一致.mtx加压后,il-32-igg4(fc)融合蛋白的表达量明显升高.[结论]成功构建了人il-32蛋白融合基因的真核表达载体il-32-igg4(fc)-poptivec,获得了能够表达具有生物学活性的il-32-igg4(fc)融合蛋白的cho/dg44细胞克隆.