人端粒酶逆转录酶(htert)基因腺病毒载体的构建及包装

【目的】构建能够表达人端粒酶逆转录酶（htert）基因的腺病毒。【方法】通过对pci-neo-htert质粒的改造，依次构建出jmb293-htert、padtrack-htert载体，将padtrack-htert经pmeⅰ线性化后与padeasy-1载体共转化到bj5183细菌中进行重组，经卡那霉素抗性筛选获得重组腺病毒载体padeasy-htert。将padeasy-htertpacⅰ酶切线性化并回收后，转染hek293人胚肾细胞，培养7d后，收集细胞并反复冻融，收集细胞裂解液；反复扩增3次后，测定重组htert腺病毒的滴度。【结果】①利用酶切连接的方法得到了穿梭载体padtrack-htert；②通过同源重组将外源目的基因htert整合到腺病毒骨架载体中，得到重组质粒padeasy-htert；③成功获得了滴度为6.73×1010gfu/ml的高滴度腺病毒颗粒。【结论】含有htert基因的重组腺病毒颗粒包装成功，为后续哺乳动物原代细胞永生化研究奠定了基础。