ppvsybrgreenⅰ实时荧光定量pcr检测方法的建立及应用

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒（ppv）的sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr方法。【方法】根据genbank中的ppvvp2基因序列，设计并合成1对引物。通过常规pcr，扩增猪细小病毒vp2基因，并将其纯化的pcr产物克隆入pgem-teasy载体中，构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和mg2+浓度条件进行优化，建立最佳的荧光定量pcr反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板，建立sybrgreenⅰ荧光定量pcr方法，对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的sybrgreenⅰ荧光定量pcr方法，对临床60份疑似ppv病料进行检测，同时与血凝试验(ha)和常规pcr方法的检测效果进行比较。【结果】在25μl扩增体系中，mg2+终浓度为4.5mol/l、sybrgreen染料浓度为20μmol/l、引物浓度为25μmol/l时，本底反应最小、循环阈值最低、扩增效率最高。所建立的sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr方法能够特异、定量地检测猪细小病毒，灵敏度达20tcid50/ml；在临床样品检测中，其检出率比常规pcr方法高13.3%。【结论】成功建立了ppvsybrgreenⅰ实时荧光定量pcr检测方法，为临床猪细小病毒的早期诊断及定量分析病毒的感染程度奠定了基础。