利用crispr/cas9敲除斑马鱼细胞周期蛋白m2(cnnm2)基因

细胞周期蛋白m2(cnnm2)是参与体内镁离子平衡的重要候选基因,实验采用的crispr/cas9系统是近几年发展起来的一类新型基因打靶技术。在斑马鱼cnnm2基因的一号外显子处选取打靶位点,构建sgrna表达载体。随后将体外转录的sgrna和cas9mrna混合物分别以约30pg和300pg的剂量显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中实现对目的靶基因cnnm2的敲除。24~48h后pcr产物回收,限制性酶切法初步检测基因打靶情况,最后进行测序分析确定突变类型。为进一步验证突变的稳定遗传性,选择了具有敲除效率的f0与野生型斑马鱼进行外交,对获得的f1进行逐一剪尾,提取dna进行pcr和测序分析。结果显示f0和f1均获得了不同程度插入、缺失和移码突变类型,且f0突变效率为88%。本研究获得了能稳定遗传的cnnm2基因敲除斑马鱼个体,并为将来进一步研究cnnm2基因和机体镁离子稳态之间的关系打下了基础。