尼罗罗非鱼肝cdna文库的构建

用stratagene技术构建了吉富品系尼罗罗非鱼(oreochromisniloticus,giftstrain)肝cdna文库。首先用trizol法提取肝总rna,经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测,表明总rna纯度高且完整性良好。然后分离纯化mrna,合成双链cdna之后,加ecorⅰ接头、ecorⅰ末端磷酸化、xhoⅰ消化,并用葡聚糖凝胶柱层析分级收集cdna样品,得到300mgcdna,符合建库要求。双链cdna与uni-zapxrvector连接后,用gigapackⅲgoldpackagingextract进行体外包装得到cdna文库。测得的文库滴度为1.25×107pfu/ml,文库噬菌体的滴度符合文库保存和筛选实验的要求。随机挑选20个阳性单克隆噬菌斑进行pcr鉴定后,得出文库的重组率达100%,扩增出的片段主要集中在0.5~2kb之间,平均插入片段长度约为1.05kb,结果说明本实验所构建的cdna文库质量较高。取扩增文库80μl进行体外切割,约含3.6×106个重组子,切割后phagemid量为2.0×106,切割效率为79.4%。经抽提质粒获得质粒dna约1.2mg。