杜氏盐藻异养表达载体的构建及异养转化株的鉴定

分别构建杜氏盐藻诱导型和组成型异养表达载体,筛选并初步鉴定异养转化藻株。通过rt-pcr从人胎盘组织中克隆并鉴定人红细胞葡萄糖转运基因(glut1),构建以诱导型双拷贝碳酸酐酶启动子(dca)驱动glut1表达的中间载体,然后与筛选标记bar盒连接形成盐藻诱导型异养表达载体pmddgn-bar。此外,将puwgus(简称g5)质粒的gus基因去除,回收大片段载体后与glut1基因连接,构建以组成型启动子ubiquitin驱动的组成型异养表达载体g5glut1-bar。通过电击转化法转化盐藻,使glut1得到表达,筛选具有草丁膦(ppt)抗性的表达glut1的盐藻转化株。提取转化株总rna,rt-pcr检测目的基因的整合。克隆获得了1479bp的glut1序列,编码493个氨基酸。电泳检测各酶切结果表明glut1、dca、nos和bar盒已依次连接到相应的载体上,说明异养表达载体构建成功。经ppt筛选数周后,转化藻株生长良好,而对照野生藻株全部死亡。电泳检测rt-pcr产物表明两株转化株在相应位置(约250bp处)出现了较为特异的扩增条带,blast同源性分析显示序列与人glut1基因的同源性为100%。诱导型和组成型启动子驱动的盐藻异养表达载体构建成功,glut1基因确已整合到盐藻的基因组中,构建的表达载体可用于盐藻中glut1基因的表达。