二步法黑曲霉脂肪酶基因lipa的全基因合成及其在毕赤酵母中的高效表达

黑曲霉脂肪酶是重要的工业用酶,在食品、制药等领域具有广泛的用途。获得黑曲霉脂肪酶高效表达的基因工程菌是该脂肪酶规模化应用的前提。通过全基因合成对目的基因进行分子改造和人工组建是实现基因高效表达和体外分子进化的有效手段。本研究主要针对一步法长片段基因合成中复杂结构的非特异性配对和过多的pcr引入碱基错配等问题,采用二步法(组装pcr和酶切-酶连)合成了黑曲霉脂肪酶基因lipa。首先在dna2.0和gene2oliga软件辅助下对lipa基因密码子及rna二级结构进行优化并引入clai(237位)和psti(475位)酶切位点;通过组装pcr分别合成lipa基因的各片段f1(237bp)、f2(238bp)和f3(422bp);通过该基因内的clai和psti限制性酶切位点连接成完整的全长lipa基因。本方法有效地降低了长片段合成过程中寡核苷酸片段的非特异性配对、复杂的二级结构以及碱基突变对dna合成的影响,提高了长片段合成的成功率。经密码子优化后的脂肪酶基因(lipa-syn)在毕赤酵母gs115中经诱导表达72h后,发酵液酶活达176.0u/ml,蛋白质含量为143.7mg/l,较出发基因分别提高了10.8倍和5.6倍。实现了该基因的高效表达,并为产酶参数的优化和酶的规模化制备奠定了基础。