专一切割苹果锈果类病毒多体自切割核酶的克隆和转录物的体外活性测定

将苹果锈果类病毒的1个14nt的靶序列连接在锤头型核酶的3′末端，构成自切割核酶。经人工合成和pcr扩增，克隆在转录载体pgem7zf（＋）的xhoⅰ-hindⅲ位点。利用限制酶xhoi与sali的连接，消失其识别位点序列，将自切割核酶片段插入到重组质粒中，经连续5次亚克隆，分别获得2、4、6、8、10和12拷贝的多体自切割核酶。在t7rna聚合酶作用下，线性化重组质粒转录的多体自切割核酶通过内部的顺式切割释放出较多数量的核酶分子，提示在转录水平能够提高核酶转录物的浓度。用相同摩尔浓度的单体和12体自切割核酶分别对32p标记的靶assvd进行反式切割，核酶与靶rna摩尔浓度比为1：1。放射自显影结果表明：多体自切割核酶对靶assvd的切割效率明显高于单体自切割核酶。我们推测多体自切割核酶在体内系统中可能具有更好的应用价值。