苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析

选择本实验室分离的苏云金芽胞杆菌李氏亚种(subsp.leesis)菌株ybt833、鲇泽亚种(subsp.aizawai)菌株ybt-1416和库斯塔克亚种(subsp.kurstaki)菌株ybt1535为出发菌株，以营养期杀虫蛋白基因pcr扩增的特异片段为探针，进行总dna酶切片段的southern杂交定位。结果显示3株菌株的营养期杀虫蛋白基因，均位于经xbai完全消化的4～5kb大小的dna片段上。将该区域dna片段回收后克隆到puc19载体，建立了3个较基因组文库小的亚基因组文库。通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定分别得到3个相应的营养期杀虫蛋白基因vip83、vip14和vip15,并对其测序。dna序列比较发现基因vip83与已知营养期杀虫蛋白基因存在5个差异碱基。将vip83、vip14基因亚克隆到苏云金芽胞杆菌大肠杆菌穿梭载体pht315,分别得到重组质粒pbmb8901和pbmb8902。将它们电转化到vip-的b.t.受体菌bmb171和4q7，获得了相应的工程菌bmb8901-171，bmb8902-171，bmb8901-4q7和bmb8902-4q7。sds-page电泳检测均有88kd大小的蛋白表达。生物测定结果亦表明了，营养期杀虫蛋白vip83和vip14对鳞翅目棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾的三龄幼虫均有一定的杀虫活性；其中对小菜蛾的毒力最高，lc50值分别为28.6，31.6，45.4和37.6μl/ml。该结果为构建高效广谱工程菌提供了实际材料和理论依据。