鸡新城疫病毒heb02分离株f基因的克隆及其dna疫苗的研究

根据genbank报道的鸡新城疫病毒f基因序列设计了一对引物，以鸡新城疫病毒heb02分离株基因组为模板，通过rt-pcr扩增出了1.66kb左右的f基因片段，序列分析表明heb02株f基因与国内标准强毒株f48e9及弱毒疫苗lasota和clone30的f基因核苷酸序列的同源性分别为88.1%、84.9%和83.8%。将heb02株f基因插入真核表达载体pvax1中，构建了真核表达质粒psv-f，通过脂质体转染cos-7细胞，sds-page分析可见表达的特异蛋白条带；westernblot、elisa和中和试验检测结果表明：真核表达的蛋白与抗新城疫病毒的抗体发生特异性反应，说明f蛋白具有很好的免疫原性。采用活体电击法以真核表达质粒psv-f免疫3周龄spf鸡，剂量为50μg/只，3周后加强免疫1次，5周后以100倍鸡胚感染剂量(eid)的f基因同源病毒对所有鸡进行攻毒，攻毒前后每周分别以喉拭子进行病毒分离和hi效价测定。结果显示对照组在攻毒前一直没有检测到抗体效价，攻毒后检测效价为3.0log2±1.40，并且于攻毒后第9天全部死亡；活疫苗组和实验组免疫后第2周检测到抗体效价，第5周最高，hi效价分别为8.3log2±1.30和7.2log2±1.23，攻毒1周后hi效价分别达9.8log2±1.55和8.9log2±1.77,极显著高于对照组（p＜0.01)。免疫组未分离到新城疫病毒，对照组全部分离到新城疫病毒。表明所构建的f基因真核表达质粒可作为候选基因疫苗诱导鸡产生免疫保护反应。