利用枯草芽孢杆菌ytka和ywof基因启动子与信号肽重组分泌表达mpd基因

用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pnw33n和去除了信号肽编码序列的成熟mpd基因构建了穿梭启动子探针pnw33n-mpd。用该探针从质粒pmpdp3和pmpdp29上克隆来自于枯草芽孢杆菌ytka和ywof基因上游的启动子功能片段，构建了穿梭表达载体pnytm和pnywm。将表达载体pnytm和pnywm转入枯草芽孢杆菌1a751获得表达菌株1a751(pnytm)和1a751(pnytm)，mpd基因在ytka和ywof基因的启动子和信号肽的带动下实现了分泌表达且具有天然活性，结果表明ytka基因的启动子强度强于ywof基因的启动子。利用ytka基因的强启动子和nprb基因的分泌型信号肽编码序列构建了新的穿梭分泌表达载体pynmk，并使mpd基因在枯草芽孢杆菌wb800中得到了更高水平的分泌表达，表达菌株wb800(pynmk)在培养到第84h时甲基对硫磷水解酶酶活达到最高值为10.40u/ml，是出发菌株邻单胞菌m6表达量的10.8倍，重组表达产物有91.4%分泌在培养基中。