超耐热酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在酵母细胞中的表达

用pcr方法扩增来源于极端嗜热厌氧古菌pyrococcusfuriosus中的超耐热酸性α-淀粉酶的结构基因，将该结构基因引入载体ppic9k中，将重组质粒ppic9kamy转化大肠杆菌dh5α细胞，测序结果表明，克隆到的α_淀粉酶结构基因为1305bp,其编码的成熟肽为435个氨基酸。将正确构建的重组质粒转化毕赤酵母gs115细胞,得到酵母工程菌株。在酵母α-factor及aox1基因启动子和终止信号的调控下，超耐热酸性α-淀粉酶在甲醇酵母中大量表达并分泌到胞外，该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导，随着诱导培养时间的增加，在培养基上清液中的单位体积酶活力相应上升，在诱导培养7d后酶活力达到最大值。该酶最适反应温度为90～100℃，最适反应ph值为4.5～5.5。该酶具有非常好的温度稳定性，在100℃条件下热处理5h，仍具有60%以上的酶活力。该酶的这些优点使其非常适于在工业生产上应用。