人神经元素3基因重组逆转录病毒表达载体的构建及其包装细胞株的建立

为构建表达人神经元素3基因(neurogenin3，ngn3)的重组逆转录病毒载体，建立稳定表达ngn3的包装细胞株，本研究以流产人胎儿胰腺组织为材料，通过rt-pcr方法克隆出人ngn3基因，将其连接到pmd18-t载体上并测序，结果表明，测序得到的基因序列与发表的人ngn3基因序列(genbankaccessionno.bc126468)完全一致。将ecori和hpai双酶切后的基因片段构建到pmscv-neo逆转录病毒载体中，酶切鉴定结果表明，pmscv-ngn3重组逆转录病毒载体构建成功。脂质体法将pmscv-ngn3重组载体导入pt67包装细胞，g418筛选后，对得到的细胞株进行rt-pcr和免疫组化检测，结果显示，该细胞株在mrna水平和蛋白水平均稳定表达ngn3；收集该细胞株的培养上清液，进行rt-pcr检测及电镜观察，结果表明，该细胞株将导入的重组逆转录病毒载体pmscv-ngn3包装成了具有感染性的病毒颗粒，并将其释放到了培养上清液中。以上结果表明pt67-ngn3包装细胞株建立成功。该细胞株的成功建立，为下一步将ngn3基因应用于提高人胎儿胰腺祖细胞诱导分化效率方面的研究奠定了基础。